免疫浸润分析：CIBERSORT / ssGSEA

跟完这篇，您能从一份 bulk 表达谱出发，用 CIBERSORT 或 ssGSEA 估出每个样本的免疫细胞构成，再把结果接到分组比较或关键基因上，出一张能讲清楚的箱线图、堆叠条形图或相关热图，并且知道这类估计能说到哪、不能说到哪。

这类方法在估什么

bulk RNA-seq 或芯片测到的，是一整块组织里所有细胞混在一起的平均表达。免疫浸润分析想回答的是：这块组织里，各类免疫细胞大致占多少、活跃到什么程度。

思路很朴素：不同免疫细胞各有一套标志基因，如果某类细胞在样本里多，它那套标志基因的整体表达就会被「顶」高。于是我们反过来，从混合表达谱去反推每类细胞的相对多少。这一步得到的不是真实细胞数，而是一个相对的比例或活性估计。

它常用来做三件事：

• 描述某种组织、某组病人的免疫「地貌」——哪几类细胞多、哪几类少。
• 比较两组之间（如高低表达组、有无突变组）某类免疫细胞的差异。
• 看某个关键基因的表达，和某类免疫细胞浸润是否同增同减。

CIBERSORT 与 ssGSEA：反卷积 vs 打分

两者都做免疫浸润，但底层是两套不同思路，结果的含义也不一样，别混着解读。

CIBERSORT 走「反卷积」：把混合表达谱当成各细胞类型表达谱按比例的叠加，用一份细胞特征矩阵（经典的是 LM22，覆盖 22 种免疫细胞亚群）作参照，用支持向量回归把比例解出来。输出是相对比例，一个样本内各类型加和约为 1，另外还给一个置换检验 P 值，衡量这次拟合可不可信。

ssGSEA（single-sample GSEA）走「打分」：对每个样本、每套免疫细胞标志基因集，按基因在该样本内的表达排名算一个富集分数。分数高，说明这套标志基因在该样本里整体偏高，对应细胞的浸润倾向更强。输出是相对活性得分，不代表比例、也不加和为 1。

维度	CIBERSORT（反卷积）	ssGSEA（打分）
思路	把混合谱拆回各细胞类型的比例	按标志基因集给每个样本打富集分
输出含义	相对比例，样本内加和约为 1	相对得分，不代表比例、不加和
依赖	一份细胞特征矩阵（如 LM22，22 种细胞）	一套免疫细胞标志基因集
典型解读	「这个样本里 CD8 T 细胞约占 X%」	「A 组的 CD8 T 细胞浸润得分高于 B 组」
常见实现	CIBERSORT / CIBERSORTx、immunedeconv	GSVA（method = "ssgsea"）

一句话记忆：要「占多少比例」用反卷积，要「哪组更高」用打分。 实际做时两种常一起跑，互相印证。

除这两者外，同类方法还有不少，思路各有侧重，这里给个速查表，本篇只展开前两者：

方法	输出	特点
CIBERSORT / CIBERSORTx	相对比例（CIBERSORTx 可给绝对量）	LM22 反卷积，最经典
ssGSEA（GSVA）	富集得分	依赖标志基因集，用途广
ESTIMATE	免疫／基质／纯度总分	不分细胞亚型，只给整体免疫评分
xCell	富集得分	覆盖细胞类型多
MCP-counter	丰度得分	同一细胞类型可跨样本比
quanTIseq / EPIC	绝对比例	给可跨样本比的绝对分数

第一步：先把输入表达谱准备对

方法再好，喂错数据也白搭。免疫浸润对输入有几条通行要求：

1. 矩阵形状：行是基因、列是样本；行名用官方基因 symbol，好和特征矩阵、标志基因集对齐。
2. 基因去重：同一 symbol 对应多探针／多行时，按惯例保留表达最高（或均值最大）的那一行。
3. 样本间可比：尽量同一平台、同一流程处理，留意批次；跨平台混用前先想清楚可比性。
4. 表达值类型：不同方法对「用 log 还是不用 log」的偏好不同，见下表。

方法	建议输入	空间
CIBERSORT	TPM（芯片用归一化后的值）	线性、非 log
ssGSEA	log2(TPM + 1) 或 TPM 均可	基于秩次，相对稳健

去重可以用这段标准写法：

# expr:基因(行) x 样本(列),行名是 symbol,可能有重复
expr <- expr[order(-rowMeans(expr)), ]        # 按行均值从大到小排
expr <- expr[!duplicated(rownames(expr)), ]   # 同名只留均值最大的第一行

这些是常用惯例、非铁律，具体按您的数据和所选实现的文档调整。表达矩阵怎么从测序数据一步步做出来，见 RNA-seq 分析全流程。

第二步：跑 CIBERSORT / ssGSEA

下面给两种方法的最小骨架，代码用来说明流程，不必当作可直接运行的完整脚本。

CIBERSORT（借 immunedeconv 包统一接口）。注意：CIBERSORT 的源码与 LM22 特征矩阵有使用许可，需从官网注册获取后再注册本地路径：

library(immunedeconv)

# 源码与 LM22 从 CIBERSORT 官网获取后,注册本地路径(需先注册账号)
set_cibersort_binary("./CIBERSORT.R")
set_cibersort_mat("./LM22.txt")

# expr_tpm:基因(symbol) x 样本 的 TPM 矩阵,线性空间
res <- deconvolute(expr_tpm, method = "cibersort")
# res:每种免疫细胞在各样本中的相对比例(每列样本加和约为 1)

ssGSEA（用 GSVA 包）。免疫细胞标志基因集可采用文献整理好的公开版本（如 Bindea、Charoentong 等）：

library(GSVA)

# expr:基因 x 样本 矩阵(log2-TPM 可)
# gene_sets:各免疫细胞的标志基因集,named list

# 新版 GSVA(≥1.50):先建参数对象,再跑
par <- ssgseaParam(as.matrix(expr), gene_sets)
es  <- gsva(par)
# es:每个样本在每套免疫细胞基因集上的富集得分
# 旧版写法:gsva(expr, gene_sets, method = "ssgsea")

跑完 CIBERSORT 后，按惯例可用置换检验 P（如 P < 0.05）筛掉拟合不佳的样本再往下分析——这是常用惯例、非铁律，按数据实际情况定。ssGSEA 没有这一步，它对每个样本都会给分。

第三步：和分组或关键基因关联出图

估出细胞构成只是中间产物，真正要讲的故事在关联这一步。常见有三种出法。

组间比较（箱线图 + Wilcoxon）

看某类免疫细胞在两组间是否不同，常用箱线图加非参数检验：

library(tidyverse)

# frac:样本 sample、分组 group,加上各细胞类型的比例(或得分)
frac_long <- frac %>%
  pivot_longer(-c(sample, group), names_to = "cell", values_to = "value")

ggplot(frac_long, aes(group, value, fill = group)) +
  geom_boxplot(outlier.size = 0.5) +
  facet_wrap(~ cell, scales = "free_y") +      # 每类细胞一格
  ggpubr::stat_compare_means(method = "wilcox.test", label = "p.format")

多组比较、以及 Wilcoxon 之外何时该换检验，见 统计方法怎么选。多个细胞类型同时比时，务必对 P 值做多重检验校正，否则假阳性会很多。

与关键基因相关（Spearman）

看某个基因的表达和某类免疫细胞浸润是否同增同减，常用 Spearman 相关（对离群更稳、不要求正态）：

# gene_expr:关键基因表达向量;score:某免疫细胞的得分或比例(样本顺序对齐)
cor.test(gene_expr, score, method = "spearman")

多个基因对多类细胞时，把两两相关系数算成矩阵，画成相关性热图，一眼看出哪对最强：

# genes_expr:样本 x 关键基因;cell_scores:样本 x 细胞类型(行样本已对齐)
M <- cor(genes_expr, cell_scores, method = "spearman")
pheatmap::pheatmap(M)                          # 行:基因 列:细胞类型,颜色=相关方向与强弱

整体免疫地貌（堆叠条形图）

想一眼看清每个样本的细胞构成，用堆叠条形图（更适合 CIBERSORT 的比例，加和约为 1）：

# frac_long 同上:sample、cell、value
ggplot(frac_long, aes(sample, value, fill = cell)) +
  geom_col(position = "stack") +               # 每个样本一根,堆叠各细胞比例
  theme(axis.text.x = element_blank())         # 样本多时隐藏样本名

结果怎么读、怎么写

图出好了，落到笔头。读和写时守住几点，结论才立得住：

• 先说清用的是哪种估计：写明方法（CIBERSORT 还是 ssGSEA）、参考（LM22 或哪套基因集）、输入是什么表达值，别人才能复现。

• 组间比较要报检验和校正：给出 Wilcoxon（或所换检验）的 P 值，并说明是否做了多重检验校正。

• 相关要同时报系数和方向：Spearman ρ 的大小与正负都写上，别只说「显著相关」。

• 一句话范式（可直接改用）：

  与低表达组相比，基因 X 高表达组的 CD8 T 细胞浸润得分显著更高（Wilcoxon p < 0.05）；且 X 表达与 CD8 T 细胞得分呈正相关（Spearman ρ = 0.4，p < 0.001）。

  （句中数字仅为示例格式，请换成您自己的真实结果。）

边界：这是估计，不是细胞计数

这一步最容易出问题，写结论前请守住这几条线：

• 是估计，不是实测。 结果高度依赖所选的参考矩阵或标志基因集，换一套参照，数值甚至排序都可能变。它替代不了流式、免疫组化或单细胞这类直接测量。
• 相对，不是绝对。 CIBERSORT 给的是样本内相对比例，跨样本比较某一类型的绝对量要谨慎；ssGSEA 的得分只在同一基因集内、跨样本比才有意义，不同细胞类型之间的分值不能直接横比。
• 注意参照的适用范围。 像 LM22 这类特征矩阵主要基于外周血免疫细胞，用到实体瘤或其它组织时可能不完全贴合，解读要留余地。
• 低丰度细胞噪声大。 占比很低的细胞类型，估计波动大，别在它上面下太重的结论。
• 别当细胞计数报。 描述结果时说「浸润得分更高」「估计比例更高」，而不是「多了 N 个细胞」。有条件时，用另一种方法或独立证据（如单细胞、免疫组化）交叉验证，结论会稳得多。

在平台上跑一遍

在百沐一下，您不用自己配 R 环境、找特征矩阵或对齐基因集：上传表达矩阵，说清「做免疫浸润、按分组比较」，智能体会挑合适的方法把 CIBERSORT／ssGSEA 跑完，出好箱线图、堆叠条形图或相关热图，并把上面这些边界一并提示给您，同时附可复现的 R 代码。想先了解它怎么理解您的数据和目的，见 组学智能体，或直接开始：https://app.baimuyixia.com。

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