单细胞质控三指标怎么设阈值

跟完这篇，您能针对自己的单细胞数据，看着分布把 nFeature_RNA、nCount_RNA、线粒体比例三条质控线定下来，滤掉低质量细胞和双细胞，又不至于把真实细胞群一起滤掉。

单细胞下游的聚类、注释、差异，都建立在「留下来的每个细胞都是一个健康的、单个的细胞」这个前提上。质控就是把不满足这个前提的液滴挑出去。整篇按这条线走：

读入数据，算出三个质控指标（含线粒体比例）；
画分布图，看着自己的分布定三条阈值线；
用专门方法补处理双细胞与空液滴；
过滤，再回头检查有没有滤过头。

三个指标各反映什么

先弄清这三个数分别在说什么，才谈得上怎么卡：

指标	含义	太低说明	太高说明
nFeature_RNA	这个细胞里检测到的基因数	空液滴、破损细胞、低质量	疑似双细胞（两个细胞挤进一个液滴）
nCount_RNA	这个细胞里的 UMI 总数（总转录本数）	建库效率低、细胞将死	疑似双细胞或超大细胞
percent.mt	线粒体基因占总表达的百分比	——	细胞膜破裂、胞质 mRNA 漏出、细胞将死

三者背后其实是同一件事的不同侧面：

nFeature_RNA 和 nCount_RNA 高度相关，一般一起看。两头都要留意：太低多半是没装进完整细胞，太高常是一个液滴里裹了两个细胞。
线粒体比例是「细胞死没死」的信号灯。细胞破裂时，胞质里的 mRNA 先漏出去，线粒体因为有膜包着相对留存，于是线粒体转录本的占比被动升高。所以线粒体比例高，通常代表这是个正在死亡或已受损的细胞。

读入数据、把线粒体比例算出来

nFeature_RNA 和 nCount_RNA 在 Seurat 建对象时会自动算好，线粒体比例要自己按基因名前缀统计。先把矩阵读进来、建立对象：

library(Seurat)

# 读入 10x 的三件套（barcodes / features / matrix 同放一个目录）
counts <- Read10X(data.dir = "filtered_feature_bc_matrix/")
# 若拿到的是 .h5，改用 Read10X_h5("filtered_feature_bc_matrix.h5")

# 建对象时先做一道最粗的过滤：
#   min.cells    —— 基因至少在这么多细胞里出现，才保留
#   min.features —— 细胞至少测到这么多基因，才保留
# 3 和 200 是 Seurat 教程常用起点，属于惯例，按数据调、不是铁律
seu <- CreateSeuratObject(
  counts       = counts,
  project      = "my_sample",
  min.cells    = 3,
  min.features = 200
)

再按基因名前缀算线粒体比例。人类线粒体基因以 MT- 开头，小鼠是 mt-，别搞混物种：

# 人类：以 MT- 开头的基因即线粒体基因
seu[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(seu, pattern = "^MT-")

# 小鼠请改成小写前缀
# seu[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(seu, pattern = "^mt-")

算完 percent.mt 会作为一列存进对象的 meta.data，和 nFeature_RNA、nCount_RNA 并列，后面一起看分布、一起做过滤。

提示：如果画出来 percent.mt 几乎全是 0，多半是前缀写错了（物种不对，或参考基因组里线粒体基因用了别的命名）。先回去核对基因名，别急着往下走。

看分布、按分布定阈值

**最关键的一条：阈值要看着自己数据的分布定，不要照抄别人教程里的数字。**同样是「线粒体 < 10%」，放在 PBMC 上很合理，放在心肌、肝脏这类线粒体本就丰富的组织上就会把好细胞误杀。做法是先画三张小提琴图，看清分布再下刀：

VlnPlot(seu,
        features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"),
        ncol = 3, pt.size = 0)

# 配合散点图看两两关系，帮助判断上界
FeatureScatter(seu, "nCount_RNA", "percent.mt")
FeatureScatter(seu, "nCount_RNA", "nFeature_RNA")

看图时按这个思路找拐点：

主群体在哪：小提琴的「肚子」是绝大多数正常细胞所在区间，阈值应落在肚子之外的稀疏尾巴上，而不是切进主群体。
下界（去空液滴、碎片）：nFeature_RNA 在低端往往有一小撮离群点，把它们和主群分开的那条缝，就是下界的候选位置。
上界（防双细胞）：nFeature_RNA / nCount_RNA 特别高的一小撮，疑似双细胞。上界可以先松一点，把真正的双细胞交给下一节的专门方法处理，避免误伤真实的大细胞。
线粒体上界：看 percent.mt 小提琴的主群体延伸到哪，再往上留一点余量设界。

一组常被引用的起点值（源自 Seurat 官方 PBMC 教程，仅供参照，不是标准答案）：

指标	PBMC 教程用的起点	说明
nFeature_RNA 下界	> 200	低于此多为空液滴 / 碎片
nFeature_RNA 上界	< 2500	仅 PBMC 情形，别硬套
percent.mt 上界	< 5	免疫细胞可用，其它组织常需放宽

这些都是常用惯例、不是铁律。线粒体阈值尤其要因组织而异——同一条 < 10% 换个组织就可能太严或太松：

组织 / 样本类型	线粒体比例常用上界	为什么
PBMC、外周血免疫细胞	< 5%〜10%	代谢平缓，线粒体占比本就低
多数培养细胞系、常规实体组织	< 10%〜20%	折中区间，看尾巴切
心肌、骨骼肌、肝、肾	< 20% 甚至更高	线粒体天生丰富，卡太严会误杀好细胞

单核 vs 单细胞、新鲜 vs 冻存样本也会整体平移分布，同一套阈值未必能跨样本通用。一个稳妥的习惯：阈值大致在看分布时定好就别反复微调到「结果好看」，并把最终数字写进方法学，保证可复现。

处理双细胞与空液滴

nFeature 的上界只能挡住最粗的双细胞。下面两类问题需要专门的方法，别指望三条阈值线包办。

双细胞（doublet）——两个细胞进了同一个液滴，被当成一个「表达谱混合」的细胞，容易在聚类里冒充「中间态」新群，是假发现的高发来源。常用工具的共同思路都是：造一批人工双细胞当参照，再看每个真实细胞长得有多像双细胞。

工具	语言	特点
DoubletFinder	R	与 Seurat 流程衔接顺，需先扫 `pK` 参数
scDblFinder	R（Bioconductor）	较新、较快，一步打分
Scrublet	Python	scanpy 生态常用

这类方法要在标准降维聚类跑完之后做：

# 前置：NormalizeData → FindVariableFeatures → ScaleData →
#       RunPCA → RunUMAP → FindClusters 已跑完
library(DoubletFinder)

# 预期双细胞数 = 双细胞率 × 细胞数
# 10x 的经验规律：装载越多，双细胞率越高（约每千个细胞增加不到 1%），
# 具体比率请以试剂 / 仪器说明为准
nExp <- round(0.075 * ncol(seu))   # 例：约 7.5%，按实际细胞数换算

DoubletFinder 还需要先用 paramSweep 系列函数扫出最优 pK 再正式运行，且函数名（是否带 _v3 后缀）随包版本变化。这里只给到思路和关键参数，具体调用请对照您所装版本的官方文档，不要照抄固定的函数签名。

空液滴（empty droplet）——液滴里没有细胞、只有环境游离 RNA（ambient RNA）。如果您用的是 CellRanger 输出的 filtered 矩阵，这一步 CellRanger 已经替您做过初筛；若从 raw（未过滤）矩阵起步，可用 DropletUtils 包的 emptyDrops() 区分真细胞与空液滴。环境 RNA 的污染另有 SoupX、DecontX 等工具校正，属于进阶步骤，按需再引入。

过滤，并检查有没有滤过头

阈值定好后用一行 subset() 过滤。三条线用 & 串起来（下面的数字只是示例，请换成您自己看分布定的值）：

seu.filt <- subset(
  seu,
  subset = nFeature_RNA > 200 &
           nFeature_RNA < 2500 &
           percent.mt   < 10
)

**过滤最怕滤过头——把某个真实细胞群整片切掉却不自知。**过滤完一定要回头对一次账：

看留了多少：细胞数掉太多要警惕。

ncol(seu)        # 过滤前
ncol(seu.filt)   # 过滤后

重画小提琴图：确认尾巴被切掉、主群体完好无损。

VlnPlot(seu.filt,
        features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"),
        ncol = 3, pt.size = 0)

分样本、分群体核对损耗是否均匀：如果某一个样本或某一群细胞被过滤掉了大半，往往不是「它们都是坏细胞」，而是阈值对这部分太严——比如把一个线粒体天然偏高的细胞类型整片误杀。这种不均匀的损耗，是需要回头放宽阈值的信号。

判断标准没有统一数字，但可以记住方向：宁可先松一点、多留一些边缘细胞，也别一刀切得太狠——低质量细胞在后续聚类里通常会自成一群、容易识别，而被误删的真实细胞群则再也找不回来了。过滤是可以迭代的：看完聚类结果，若发现某群明显是残余低质量细胞，再回来收紧对应指标即可。

在平台上跑一遍

在百沐一下做这一步不用写代码：上传单细胞矩阵后，平台会自动算好 nFeature_RNA、nCount_RNA 与线粒体比例，画出三张分布图供您看着定阈值，并给出双细胞检测；您只需说清组织类型和大致意图，它会把过滤前后的细胞数与分布一并列出来让您确认没有滤过头。到 https://app.baimuyixia.com 传一份数据就能试跑，也可先看组学智能体怎么用了解交互方式。