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细胞注释：手动 marker 与自动 SingleR

跟完这篇，您能把一张已经聚好类的单细胞图谱，从「第 0 群、第 1 群」这样的编号，落实成「CD8 T 细胞、单核细胞、B 细胞」这样的生物学身份：既会用 marker 手动判读，也会用 SingleR 自动打分，还知道两者怎么互相印证、一个标签到底可不可信怎么看。

聚类只把细胞按表达相似度分成了若干群，群还只是编号。注释就是给每个群贴上细胞类型标签。做法分两条路：一条是手动 marker 法，靠已知的标志基因人工判读；一条是自动注释，让算法拿参考数据集给每个细胞打分。两条路各有长短，稳妥的做法是都跑一遍、互相对照。

开始之前：您手上要有什么

注释是聚类之后的一步，动手前请确认两样东西已经就绪：

  1. 一份聚过类的 Seurat 对象：已经跑完标准化、降维、FindClusters，Idents() 或 seurat_clusters 里是群编号。聚类怎么做，见 单细胞聚类：从降维到分群。
  2. log 标准化后的表达数据：FindAllMarkers 和 SingleR 都在标准化后的表达上工作（Seurat 的 data 层，即 NormalizeData 的结果），不是原始 counts。

注释的目标不是「给每个群硬塞一个名字」，而是在有把握的地方下明确判断，在没把握的地方老实标成「待定」。宁可留一个 Unknown，也不要凭一个不特异的基因乱认。

如果对象做过整合（多样本用 CCA、Harmony 等对齐过），默认 assay 可能是 integrated 或 SCT，那里只留了部分基因、也不是用来做差异的层。找 marker 前先把默认 assay 切回原始表达：DefaultAssay(seurat) <- "RNA"。

手动 marker 法

手动法分两步：先让每个群自己「交出」区分性最强的基因，再拿这些基因去比对已知的细胞类型标志。

先摆一眼两条路的性格，好知道各自该派什么用场：

维度手动 marker 法自动注释（SingleR）
依据已知标志基因 + 人工判读参考数据集 + 相关性打分
速度慢，逐群看快，一次跑完
可复现依赖经验，不同人可能给不同结论参数固定，结果可复现
短板费时、要懂组织的生物学背景只和参考数据集一样好，库里没有的类型会被硬套
最适合定案、确认稀有或组织特有类型快速起底、给手动判读提供线索

第一步：找各群的 marker

用 FindAllMarkers 对每个群做「本群 vs 其余所有细胞」的差异检验，找出每群特异高表达的基因。

library(Seurat)
library(dplyr)

# 若对象整合过，先把默认 assay 切回原始表达再找 marker
DefaultAssay(seurat) <- "RNA"

# seurat 已完成聚类；默认用 Wilcoxon 秩和检验
markers <- FindAllMarkers(
  seurat,
  only.pos = TRUE,        # 只要上调的，即本群相对高表达的基因
  min.pct = 0.25,         # 至少在 25% 的本群细胞里检出：常用惯例，按需调
  logfc.threshold = 0.25  # log2FC 门槛：常用惯例，不是铁律
)

# 每群取 avg_log2FC 最高的前若干个，作为候选 marker
top <- markers %>%
  group_by(cluster) %>%
  slice_max(avg_log2FC, n = 10)

FindAllMarkers 的输出每行是「某个基因在某群」，关键列有：avg_log2FC（本群相对其余的 log2 倍数变化）、pct.1 / pct.2（在本群 / 其余群的检出比例）、p_val_adj（校正 p 值）。一个好 marker 的特征是 pct.1 高、pct.2 低——在本群普遍表达、在别处几乎不表达。

第二步：比对已知细胞类型

拿每群的 top marker 去对照该组织里公认的标志基因。下面是外周血单个核细胞（PBMC）里一些常被引用的经典 marker，供体会「怎么比对」，不同组织要换成对应的标志基因：

细胞类型常用标志基因
T 细胞（总）CD3D、CD3E
CD4 T 细胞IL7R、CD4
CD8 T 细胞CD8A、CD8B
B 细胞MS4A1（CD20）、CD79A
NK 细胞NKG7、GNLY
单核细胞CD14、LYZ
树突状细胞FCER1A

表里是示例，不是清单。每种组织、每个课题的 marker 都不一样，请以您所在领域公认的标志基因为准（可查 CellMarker、PanglaoDB 等公开数据库，或对照同组织的经典文献）。

判读时别只看一个基因是否表达，要看它是否只在这一群里表达。DotPlot 把这件事画得最清楚——一个基因的点若只在某一群又大又深、在别群又小又浅，才是可信的判据。

# 挑一组候选 marker，一次看清各群的表达分布
DotPlot(seurat, features = c("CD3D", "CD8A", "MS4A1", "CD14", "NKG7", "LYZ")) +
  RotatedAxis()

# 换个角度核验同一件事，两图配合看更踏实：
VlnPlot(seurat, features = c("CD3D", "CD14"))        # 各群的表达分布（小提琴图）
FeaturePlot(seurat, features = c("CD8A", "MS4A1"))   # 把表达画到 UMAP 上，看落在哪群

判定清楚后，把编号换成细胞类型名：

new.ids <- c("0" = "CD4 T", "1" = "CD14 Mono", "2" = "B",
             "3" = "CD8 T", "4" = "NK")            # 按您的判读结果填
seurat <- RenameIdents(seurat, new.ids)
seurat$cell_type <- Idents(seurat)                  # 存一列，便于后续引用

自动注释：SingleR 打分

手动法准，但慢、依赖经验。自动注释反过来：快、可复现，代价是结论只和参考数据集一样好。SingleR 是常用的一种，思路是拿一套已标注好的参考表达谱，为每个细胞（或每个群）跟各参考类型算相关性、打分，取分最高的类型作标签。

第一步，选参考数据集。celldex 包提供了几套现成的参考，按样本类型选：

参考数据集（celldex）适用
HumanPrimaryCellAtlasData()人，覆盖面广、类型多
BlueprintEncodeData()人，免疫与基质细胞
MonacoImmuneData()人，免疫细胞分得细

第二步，把 Seurat 对象转成 SingleR 认的格式并打分。SingleR 有两种粒度：

library(SingleR)
library(celldex)

ref <- HumanPrimaryCellAtlasData()          # 选一套参考
sce <- as.SingleCellExperiment(seurat)      # Seurat -> SingleCellExperiment

# 粒度一：逐细胞注释
pred <- SingleR(test = sce, ref = ref, labels = ref$label.main)
seurat$singler <- pred$labels

# 粒度二：逐群注释（拿聚类结果做单位，结果更稳、更省算力）
pred_cl <- SingleR(test = sce, ref = ref,
                   labels = ref$label.main,
                   clusters = seurat$seurat_clusters)
  • label.main 是粗粒度标签（如 T_cells），label.fine 更细（如具体亚型）。先用 main 看大类，需要再上 fine。
  • 逐群注释（给 clusters 参数）通常比逐细胞更稳：单个细胞噪声大，落到群上做多数投票更抗噪，也更省时间。

两者互相印证

手动和自动，谁也不该单独定案。真正让人放心的，是两条独立的路走到同一个结论。做法很直接：把 SingleR 的标签和您手动判读的身份放到一张表里对照。

# 把逐细胞 SingleR 结果与手动注释交叉列表
table(manual = seurat$cell_type, singler = seurat$singler)

看这张交叉表，三种情况分别处理：

  1. 两者一致：手动认成 B 细胞、SingleR 也判 B 细胞——这一群基本可以定案。
  2. 粗细之差：手动只到「T 细胞」，SingleR 分到「CD8 T」。不矛盾，是互补，可采用更细的那个（但要回头用 marker 确认细分站得住）。
  3. 明确冲突：手动认 NK、SingleR 判单核。这是警报，别急着信任何一方——回去看这群的 marker 是不是不特异、是不是两类细胞混在了一群（见下文「常见坑」）。

参考数据集里没有的细胞类型，SingleR 只会硬套最接近的已知类型，不会说「不认识」。所以自动注释给出的类型，一定要用 marker 回验一遍，尤其是参考库里可能缺失的稀有类型或您组织特有的类型。

注释可信度怎么判断

一个标签贴上去，得能说清「凭什么」。判可信度看两个维度：marker 够不够特异、群本身纯不纯。

marker 特异性——好的判据是「本群有、别群无」：

  • DotPlot 里该 marker 只在目标群又大又深，别群点小色浅；
  • FindAllMarkers 结果里 pct.1 高而 pct.2 低；
  • 若一个「marker」在半数群里都表达，它就不特异，别拿它当判据。

SingleR 的把握度——SingleR 自带两个诊断量：

# 每个细胞对各参考类型的打分热图：好的注释应「独高一峰」
plotScoreHeatmap(pred)

# delta 分布：最高分与其余分的差距，差距越大越可信
plotDeltaDistribution(pred)

pred$pruned.labels 是 SingleR 剔除低置信后的标签：把握不足的细胞会被置成 NA。把 NA 当成「模型也拿不准」的诚实信号，不要强行填一个类型。

群纯度——一个群若是干净的单一类型，它的 marker 会集中、SingleR 打分会一致；若一群里同时冒出两套互斥的 marker（比如既有 T 细胞的 CD3D 又有单核的 CD14），说明这群很可能没分开，注释也就无从可信。

常见坑

坑表现怎么办
marker 不特异拿来判读的基因在多群都表达，认谁都像优先选 pct.1 高、pct.2 低的基因；一个类型用一组 marker 交叉印证，别靠单基因
分辨率过高，一类被切碎同一种细胞被拆成好几群，marker 几乎一样调低 FindClusters 的 resolution；marker 高度重叠的相邻群可考虑合并
分辨率过低，多类混一群一群里同时有互斥 marker（如 CD3D 与 CD14）调高 resolution 重新分，或对该群单独再聚类
参考库里没有的类型SingleR 硬套一个最接近的已知类型换更贴合的参考；一律用 marker 回验，稀有或特有类型尤其要查
双细胞（doublet）一小群同时高表达两谱系的 marker上游用 doublet 检测标记并剔除，别把它当成一种「新细胞类型」
迷信自动、跳过回验SingleR 给了标签就直接采用自动结果永远用 marker 复核，冲突的群务必查清
在整合层上找 marker忘了切 assay，marker 数目少、结果奇怪找 marker 前 DefaultAssay(seurat) <- "RNA"

分辨率没有「正确值」。resolution 调大分得细、调小分得粗，合适与否取决于您要区分到多细的类型。惯常做法是试几个值，看哪个能让已知细胞类型恰好各成一群——这本身也要靠 marker 来判断，具体怎么调见 单细胞分辨率：分群该多细。

在平台上跑一遍

不想装 Seurat、SingleR，也能完成整套注释：在 百沐一下 传入聚好类的单细胞对象，用一句话说清目的——「给各群做细胞注释，先跑 marker、再用 SingleR 对照，物种是人、组织是外周血」，平台会自动找各群 marker、调参考数据集打分、把两者交叉对照，并连同 DotPlot、打分热图和可复现的 R 代码一起交付，可信度存疑的群会替您标出来。用法见 组学分析助手使用指南。

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