批次整合：Harmony / CCA / RPCA 对比

跟完这篇，您能把来自多个样本、多次建库的单细胞数据合到一张图谱上，让同一种细胞跨样本对齐、而不是按样本各聚一堆；您会在 Harmony、CCA、RPCA 三种主流方法之间按数据规模和批次强弱选对一种，看得出整合是「不足」还是「过度」，并且知道整合之后差异分析该回到哪份数据上做。

为什么单细胞要「整合」，而不只是「去批次」

把几个样本、几次实验的单细胞数据放在一起分析，几乎必然遇到批次效应：同一种细胞，只因来自不同样本、不同建库批次，在降维图上就被拆成各自一坨。批次整合（integration） 要解决的就是这件事——让「同一种细胞」跨批次落到一起，好统一聚类、统一注释。

它和散装（bulk）RNA-seq 的「去批次」是两回事，别混为一谈：

	bulk 去批次	单细胞整合
目标	差异分析时不被批次带偏	同类细胞跨样本对齐，能一起聚类
校正对象	表达矩阵，或把批次写进模型当协变量	主要是低维嵌入（PCA 坐标），不改表达值
常态	能用协变量就不动数据	合并多样本时几乎总要做

有一条底线要先立住：只按「技术批次」整合，不要按您想比较的「生物学分组」整合。 如果把 disease / control 当成批次去对齐，等于亲手把您要研究的差异抹平了。散装数据里批次和分组的取舍，见批次效应识别与去除。

开始之前：您手上要有什么

整合发生在「建对象、质控、标准化」之后、「聚类」之前。动手前请确认：

一个合并好的 Seurat 对象，meta.data 里有一列（下面叫 batch）标明每个细胞来自哪个样本 / 批次。上游怎么走，见单细胞分析全流程与单细胞质控怎么做。
每个样本都已各自标准化、找过高变基因。整合正是在这些高变基因上做对齐。

下面示例以 Seurat v5 为准。v5 把「多样本整合」统一成 IntegrateLayers 一个入口，换方法只需换一个参数——这恰好方便我们把三种方法摆在一起比。

library(Seurat)

# obj:已 merge 的多样本对象,meta.data 有 batch 一列
# Seurat v5:先把 RNA 表达按 batch 拆成多个 layer,整合就在 layer 之间做
obj[["RNA"]] <- split(obj[["RNA"]], f = obj$batch)

obj <- NormalizeData(obj)
obj <- FindVariableFeatures(obj)
obj <- ScaleData(obj)
obj <- RunPCA(obj)

先看一眼「不整合会怎样」

在动手整合前，先用未校正的 PCA 跑一遍降维，按批次上色看看。这一步是为了确认「到底需不需要整合、以及整合后好了多少」有个对照。

obj <- FindNeighbors(obj, dims = 1:30, reduction = "pca")
obj <- RunUMAP(obj, dims = 1:30, reduction = "pca")

# 按批次上色:若同类细胞明显按 batch 分开,就说明需要整合
DimPlot(obj, reduction = "umap", group.by = "batch")

若各批次已经充分混匀、只按细胞类型分开，那批次效应很小，未必需要整合，别为做而做。
若同一群细胞被批次拆成平行的几坨，就进入下一步。
dims = 1:30 是常用取值，按肘图（ElbowPlot）微调，非固定值。

三种方法怎么跑

v5 里三种方法都是 IntegrateLayers 的一个 method 参数，输出一个新的降维（new.reduction），供后续聚类和 UMAP 使用。实际分析选一种即可；这里三种都写出来，是为了让您对照跑、对照看。

# 方法一:CCA —— 典型相关分析找跨批次的共享变异
obj <- IntegrateLayers(obj, method = CCAIntegration,
                       orig.reduction = "pca", new.reduction = "integrated.cca")

# 方法二:RPCA —— 相互投影 PCA,更保守、更快
obj <- IntegrateLayers(obj, method = RPCAIntegration,
                       orig.reduction = "pca", new.reduction = "integrated.rpca")

# 方法三:Harmony —— 在 PCA 空间迭代软聚类并逐簇校正(需先装 harmony 包)
obj <- IntegrateLayers(obj, method = HarmonyIntegration,
                       orig.reduction = "pca", new.reduction = "harmony")

拿到整合后的降维，后续步骤就把 reduction 指向它，其余和常规流程一样：

# 以选定的 RPCA 结果为例
obj <- FindNeighbors(obj, reduction = "integrated.rpca", dims = 1:30)
obj <- FindClusters(obj, resolution = 0.5)
obj <- RunUMAP(obj, reduction = "integrated.rpca", dims = 1:30)

# 左图看批次是否混匀,右图看聚类
DimPlot(obj, reduction = "umap", group.by = c("batch", "seurat_clusters"))

Harmony 也可以脱离 IntegrateLayers、用它自己的接口跑：harmony::RunHarmony(obj, group.by.vars = "batch")，同样产出一个 harmony 降维。两种入口结果一致，用顺手的即可。

三种方法的适用与代价

三种方法都在「让批次混匀」和「别把真细胞类型也混掉」之间权衡，只是取舍点不同。

方法	大致原理	更适合	代价 / 风险
Harmony	在 PCA 空间迭代做软聚类，逐簇估计并扣除批次偏移	样本多、细胞多、要快；批次结构相对温和	批次差异极强时可能校正不足；是嵌入层校正，不给校正后的表达矩阵
CCA	找跨批次的共享变异方向，据此确定「锚点」细胞对再对齐	批次差异较大但共享细胞类型多；样本数不太大	计算和内存开销大，细胞一多就慢；相对更容易过度整合，把弱差异抹平
RPCA	锚点框架同 CCA，但把每个批次相互投影到对方 PCA 空间找锚点，更保守	大数据集；批次差异大又怕过整合；已知各批共享类型明确	更保守，故批次差异极大或共享类型很少时可能整合不足；有时需调 `k.anchor`

几条实用的经验：

先试 RPCA 或 Harmony：两者都快、都稳，适合作默认起点。数据大、样本多时尤其如此。
CCA 更「敢对齐」：当不同批次共享的细胞类型很多、您担心整合不足时它有优势，但对应地更要警惕过度整合。
已有系统的基准评测比较过这类方法，共识是没有哪一种在所有场景都最好——方法选择要看批次强弱、共享类型多少和数据规模，别照搬别人论文里的选择。
换方法很便宜（改一个 method 参数），同一份数据跑两三种、对照下一节的诊断图再定，比空想哪种「更好」靠谱。

整合过度还是不足：怎么看

判断只有一条主线：按批次上色要混匀，按已知 marker / 细胞类型上色要仍然分得开。 两者兼顾才算好。

# 一图两色对照:批次该混、生物学该留
DimPlot(obj, reduction = "umap", group.by = "batch")            # 期望:各批混匀
FeaturePlot(obj, features = c("CD3D", "MS4A1", "LYZ", "NKG7"))  # 期望:各群 marker 仍清楚

对着图判断三种状态：

现象	UMAP / 聚类上的样子	判断与对策
整合不足	按批次上色，同类细胞仍被拆成各批次各一坨	校正不够。换更「敢对齐」的方法（如 CCA）、或检查高变基因是否选偏
恰当	按批次充分混匀，按 marker / 细胞类型仍清晰分开	目标状态
整合过度	本该分开的细胞类型 / 状态被并到一起；稀有群消失；marker 不再区分	校正过头，抹掉了真实生物学。换更保守的方法（如 RPCA）、或减小对齐强度

几个要点：

一定要拿已知的判别 marker 回验：找两个本应区分的细胞类型（比如 T 细胞的 CD3D 与单核的 LYZ），看整合后它们在图上是否还分得开。若被并到一起，就是过度整合的警报。
稀有群最先受害：过度整合往往先把稀有细胞并进邻近大群。若您关心某个小群，整合前后都点它的 marker 数一数。
也有定量指标——如 LISI（iLISI 看批次混合、cLISI 看类型纯度）、kBET、轮廓系数——可以把「混得够不够、纯不纯」量化。它们是有用的辅助，不是判决书：没有一个能套所有数据的硬阈值，仍要结合上面的看图与 marker 回验。
「混匀」和「保留生物学」本质是一对矛盾，越使劲混批次，越容易连真差异一起混掉。整合的手艺就是在这条张力上找平衡，没有免费的午餐。

整合之后还能做差异吗

能，但别在整合 / 校正后的数据上做差异——这是最关键、也最常被踩的一条。

原因和散装数据里「去批次矩阵不能回喂差异分析」一模一样：整合改动过的值已经不是独立的原始观测，直接拿去做统计检验会低估方差、放大显著性。好在 Seurat v5 里，IntegrateLayers 各方法（Harmony / RPCA 等）只改低维嵌入、不改表达值，所以：

整合后的降维（integrated.rpca、harmony 等）：只用来找近邻、聚类、画 UMAP，即「确定有哪些共享细胞类型」。
差异分析：一律回到未整合的 RNA 表达（log 标准化后的 RNA assay）上做。

# 整合只改了坐标,没改表达。做差异先把拆开的 layer 合回来,并切回 RNA assay
obj <- JoinLayers(obj)
DefaultAssay(obj) <- "RNA"

# 在某一细胞类型内部,按分组比较
Idents(obj) <- "cell_type"
tcell <- subset(obj, idents = "T cell")
Idents(tcell) <- "condition"
de <- FindMarkers(tcell, ident.1 = "disease", ident.2 = "control")

再进一步，跨样本、跨条件的组间差异，更稳的是「伪散装（pseudobulk）」：把每个样本、每类细胞的 counts 加总成一条「散装」样本，再用 DESeq2 / edgeR 在样本层面做差异。这样把「样本」而非「细胞」当作重复单位，才不会因为把成千上万个细胞当独立样本而虚高显著性。

# 每个 sample × cell_type 汇总为一条伪散装,再走标准差异分析
pb <- AggregateExpression(obj, assays = "RNA", return.seurat = TRUE,
                          group.by = c("sample", "cell_type"))
# 之后按 condition 用 DESeq2 做差异,阈值常用 padj < 0.05,是惯例、按需收紧

单细胞逐细胞检验（如 FindMarkers 默认的 Wilcoxon）适合在样本内看某群 vs 其余；跨条件比较时优先考虑伪散装。取舍见统计方法怎么选。
差异基因拿到手，接着常做富集看落在哪些通路，见富集分析怎么做。

在平台上跑一遍

不想在本地装 Seurat、harmony、折腾 v5 的 layer，也能完成整套整合：在百沐一下上传多样本单细胞数据（或多个矩阵 + 标注了样本 / 批次的信息表），用一句话说清目的——例如「把这几份样本做批次整合再统一聚类注释，物种是人，然后比较 disease vs control」，平台会零代码替您跑整合、给出按批次和按细胞类型上色的对照 UMAP、提示整合是否过度或不足，并在差异分析时自动回到未校正表达 / 用伪散装，连同可复现的 R 代码一起交付。用法见组学分析助手使用指南。