比对reads并定量表达（reads→counts）

Align and Quantify Sequencing Reads · 🟡进阶 · 所属分类：组学与生物信息分析

从 clean reads 到表达矩阵，是上游最耗算力、也最容易静默出错的一步——比对器怎么选、基因组和注释版本对不对得齐、链特异性有没有设反、gene 和 transcript 层级会不会混，任一处悄悄错了，下游差异分析就全盘失真。新手还常直接拿别人给的矩阵，不知来路也无法自证。它帮你把选型、建索引、比对、定量和 QC 串成一套可复现流程，并显式核验那些最容易翻车的地方，交给你一份来路清楚的 counts 矩阵。

适合谁

做 RNA-seq、想从 clean reads 自己跑出表达矩阵、或想搞清手上矩阵怎么来的本科生、研究生和生信工程师。

给它什么 · 得到什么

• 你提供：清洗后的 FASTQ（单端/双端）、物种与参考基因组+注释版本（如 GRCh38 + GENCODE 的 GTF）、文库类型与链特异性（不知道可自动推断）、平台/读长、定量目标（gene 计数还是 transcript TPM）和可用算力
• 你得到：基因×样本计数矩阵（和/或转录本 TPM）+ MultiQC 比对/定量 QC 汇总 + 可复现的 STAR/HISAT2/salmon/featureCounts 脚本（含索引构建、版本参数和参考来源）

怎么用

示例提问：「这是 12 个双端 RNA-seq 样本的 clean fastq，人 GRCh38 配 GENCODE v44，链特异性我不确定，帮我推断后跑 salmon 定量并汇总到 gene level 出 counts 矩阵。」触发后它会按你的算力和目标在 STAR/HISAT2 比对与 salmon/kallisto 伪比对间选型，核对基因组与注释版本一致、自动推断链特异性，用 featureCounts 或 tximport 出矩阵，再用 MultiQC 汇总质控，给你可复现脚本和标准 counts 矩阵直接对接下游。

提个醒

它是编排 STAR/salmon/featureCounts 这些专业工具加配参和 QC 解读，真正的建索引与比对是重算力步骤，得在你本地或 HPC 上跑（人类 STAR 索引约需 30GB 内存）；链特异性设反、版本不一致是最常见的静默错误，它会显式核验并记录。